La création de l’Académie de France à Rome coïncida avec la politique des grands travaux entreprise par Louis XIV à la fin du XVIIe siècle, par lesquels furent transformés le Louvre, les Tuileries et Versailles. Créée en 1666, sous l’impulsion de Colbert, de Le Brun et du Bernin, elle accueillait à la fois les artistes ayant remporté le Premier Prix de Rome et des pensionnaires protégés de quelques grands seigneurs. Les jeunes artistes pensionnés par le roi avaient alors la possibilité d’acquérir un complément de formation au contact de Rome et de l’Italie.

A cette époque les pensionnaires, soumis à une discipline rigoureuse, devaient consacrer leur séjour à la réalisation de copies de l’Antique ou de la Renaissance. Aux peintres et sculpteurs s’ajoutèrent en 1720 les architectes. Avant de s’installer à la Villa Médicis, l’Académie de France à Rome connut plusieurs résidences successives : de la modeste maison près de Sant’Onofrio sur les pentes du Janicule elle déménagea au palais Caffarelli (1673), puis au palais Capranica (1684), et enfin au palais Mancini (1725). C’est à cette époque que l’Académie de France accueillit les peintres Boucher, Subleyras, Fragonard, David et des sculpteurs tels que Houdon.
Pendant la Révolution, la charge de directeur fut abolie. Le palais Mancini fut saccagé et pillé par des contre-révolutionnaires romains en février 1793; certains pensionnaires fuirent à Naples ou Florence. A la suite de ces événements, l’Académie de France à Rome fut supprimée. Elle fut rétablie en 1795 par le Directoire, mais il restait à lui trouver un nouveau lieu d’accueil. Le 18 mai 1803, la France et la Cour d’Etrurie décidèrent d’échanger le Palais Mancini contre la Villa Médicis.

En déménageant, l’Académie de France à Rome changea également de statut. Désormais rattachée à l’Institut de France, le concours d’entrée, le «Prix de Rome», était organisé par l’Académie des Beaux Arts. Les musiciens entrèrent à l’Académie de France à Rome avec le prix de composition créé en 1803. Les graveurs la rejoignirent quand fut créé le prix biennal de gravure en taille douce en 1804 et le prix quadriennal de gravure en médailles et pierres fines en 1807. Ces deux disciplines devaient célébrer les victoires napoléoniennes. De 1835 à 1841, Ingres est directeur de la Villa. Les directeurs sont traditionnellement d’anciens pensionnaires, même si cette règle connaît quelques exceptions, par exemple pour Carolus-Duran. Tout au long du XIXe siècle, l’Académie accueille des pensionnaires célèbres comme Victor Baltard, l’architecte des Halles de Paris, Charles Garnier, qui fit construire l’Opéra du même nom à Paris, des compositeurs tels que Berlioz, Bizet, Gounod ou Debussy, des sculpteurs tels que Carpeaux et David d’Angers.

Au début du XXe siècle, avec Lili Boulanger (Grand Prix de Rome de composition musicale en 1913) et Odette Pauvert (Grand Prix de Rome de peinture en 1925), les femmes font leur entrée à l’Académie. Durant la seconde guerre mondiale, la Villa est réquisitionnée par Mussolini. L’Académie est alors transférée à Nice puis à Fontainebleau. En 1961, André Malraux nomme le peintre Balthus à la direction de la Villa. Les deux hommes ont la volonté de réformer profondément l’Académie. Balthus entreprend une grande restauration de l’édifice et organise des manifestations pour ouvrir la Villa aux romains. Il fait aménager, à cette fin, de nouvelles salles d’exposition. Cette nouvelle approche est entérinée par un décret en 1971. L’Académie se détache alors de la tutelle de l’Académie des Beaux-Arts et les principes du concours sont profondément modifiés.

La durée du séjour passe de quatre à deux ans maximum tandis qu’écrivains, cinéastes, photographes, scénographes, restaurateurs d’oeuvres d’art et historiens de l’art agrandissent le cercle des pensionnaires, dont le nombre passe de 12 à 25. Participant aux échanges culturels et artistiques, la Villa Médicis organise des expositions, des concerts, des colloques ou des séminaires sur des sujets relevant des arts, des lettres et de leur histoire. Conçu par le décret de 1971 comme un lieu idéal de rencontres franco-italiennes, la Villa Médicis joue ainsi un rôle décisif au sein de la vie culturelle romaine et européenne. Ces objectifs ont été au cœur des actions de Jean Leymarie (1977-1984), Jean-Marie Drot (1985-1994), Jean-Pierre Angremy (1994-1997), Bruno Racine (1997-2002), Richard Peduzzi (2002-2008), Frédéric Mitterrand (2008-2009), Éric de Chassey (2009-2015) et de Muriel Mayette-Holtz.

Enfant naturel de Marie-Françoise Dupepaye, une esclave affranchie de la Guadeloupe, et de Pierre Guillon, notaire royal à Saint-Pierre de la Martinique et procureur du roi en Guadeloupe, qui le reconnut à Paris le 7 avril 1799, ainsi que sa sœur Andrèze ne pouvant les reconnaître plutôt à cause du code noir. Guillaume Guillon Lethière présenta dès l’enfance des dispositions pour la peinture qui décidèrent son père à l’emmener en France en juin 1774 à bord de L'Éveillé, où ils accostèrent en septembre 1774 à Bordeaux.
Il fut d'abord, placé sous le nom de « Letiers » (étant le troisième fils de la famille), chez le peintre Jean-Baptiste Descamps, professeur à l’école publique gratuite de dessin, nouvellement fondée à Rouen, où il fit en trois ans des progrès rapides. Il changea plus tard son nom en « Lethiers », ensuite en Lethière qu'il conservera finalement, même si de nombreuses œuvres étaient signées « Le Thière » . Il vint ensuite à Paris et entra chez le peintre du roi, Gabriel-François Doyen, chez qui il resta jusqu’en 1786. Il fréquente l'atelier de David, chez qui il ne fut jamais élève, où ses camarades le rebaptisèrent en « Lethière ».
Ayant remporté le second prix de Rome en 1784 dont le sujet était La Cananéenne aux pieds de Jésus-Christ, il partit pour Rome. En 1787, il a un fils naturel, Alexandre, avec Marie-Agathe Lapôtre. Celui-ci mourra jeune des suites de blessures reçues sur un bateau engagé contre les Anglais pour libérer la Martinique, laissant lui aussi un enfant en bas âge que Lethière va élever.

Ayant été témoin des efforts tentés par d’éminents artistes pour ramener la peinture à l’étude de l’antique, il était décidé à suivre cette voie. Ses succès furent grands à Rome et ses études très remarquées en France. On distingua surtout son Brutus dont il présente l'esquisse au Salon de 1793. En 1795, s'éloignant du néo-classicisme, il présente au Salon un tableau qui peut-être considéré comme l'un des premiers témoignages du style troubadour, Herminie et les Bergers (Dallas Museum of Art) qui trouvera quelques années plus tard un véritable épanouissement dans les milieux proches de l'impératrice Joséphine.
De retour à Paris en 1792, il consolida sa réputation par de grands ouvrages, qui lui valurent d’être choisi en 1811 par la quatrième classe de l’Institut comme directeur de l’Académie de Rome. Son mandat lui ayant été renouvelé à l’expiration de son exercice, il y resta dix ans. Il s’y trouvait en 1818 lorsqu’il fut nommé membre de l’Académie des beaux-arts. Le roi refusa d’abord son approbation, mais il finit par l’accorder. Il reçoit les insigne de chevalier de la Légion d'honneur en 18181,2. Il prit en 1792 le parti de La Révolution et traça sur le papier et la toile les exploits du général Dumas[réf. nécessaire].
Le 14 décembre 1799, il épouse Zélie van Zen, née en 1763 aux Pays-Bas. Elle lui donnera un fils, Auguste, en 1796.
En 1800, il est à Madrid avec son protecteur Lucien Bonaparte, fraîchement nommé ambassadeur.
Au début de l'Empire, Lethière ouvre un atelier à Paris près de l'abbaye de Saint-Germain-des-Prés, au no 9 de la rue Childebert, que les élèves surnomment La Childebert, un endroit où l'on pratique à la fois l'escrime et la peinture, et où l'on refait le monde et la mode. En 1803, une rixe éclata au Café militaire de la rue Saint-Honoré, le conflit dégénéra. Lethière tue un des officiers et blesse les autres. Son atelier est fermé et il part en exil en Allemagne avec Lucien Bonaparte. Ce dernier insiste pour qu'il soit nommé à la tête de l'Académie de France à Rome. Il le fut par décret du 23 avril 1807, puis renouvelé jusqu'à janvier 1816, pour être remplacé par Pierre Guérin, par une ordonnance du roi3. De retour de la villa Médicis en 1816, il rouvre son atelier dans le quartier Saint-Germain-des-Prés, au no 9 de la rue Childebert, d’où sortirent nombre d'artistes, tels que le guadeloupéen Jean-Baptiste Gibert (1803-1889), premier prix de Rome de paysage historique en 1829, et le célèbre peintre français de l'école de Barbizon, Théodore Rousseau (1812-1867).
Il est nommé professeur de l’École des beaux-arts de Paris le 10 octobre 1819 en remplacement de Étienne-Pierre-Adrien Gois4. Il fit quatre fois le voyage d’Italie, d’Angleterre et d’Espagne.
Premier homme de couleur à s’imposer dans le monde de la peinture occidentale, Lethière a peint un tableau représentant Alexandre Pétion et Jean-Jacques Dessalines, intitulé le Serment des ancêtres et signé « Lethière, né à la Guadeloupe », qu’il offrit à la nouvelle République d’Haïti.